Научный журнал
Научное обозрение. Педагогические науки
ISSN 2500-3402
ПИ №ФС77-57475

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДИК ОЦЕНКИ ПЕРЕКИСНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ НА ОСНОВЕ ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

Вельш О.А. 1 Филончикова Е.С. 1 Трофимова Е.Е. 1
1 ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный университет»
Эритроциты, как одни из жизненно важных форменных элементов крови, постоянно подвергаются перекисному окислению, что является стрессовым фактором для мембран. В результате эволюции эритроциты приобрели резистентность к перекиси водорода, которая в свою очередь зависит от возраста форменных элементов и может уменьшаться в ходе их старения. Уменьшение резистентости эритроцитов до минимальных значений приводит к гемолизу. Гемолизом называется процесс разрушения мембран эритроцитов, сопровождающийся выходом гемоглобина в плазму крови. Гемолиз эритроцитов может быть вызван одной из активных форм кислорода – перекисью водорода. Ее образование может наблюдаться при различных процессах, таких как действие гормонов, гипероксия, инфекционные заболевания. С целью оценки перекисной резистентности в настоящем исследовании были рассмотрены две методики и выделены их недостатки и преимущества.
перекисная резистентность
эритроцит
перекись водорода
оптическая плотность
азид натрия
гемолиз
1. Бондарев Л.С., Зайцев И.А., Жидких В.Н. Влияние некоторых воздействий на осмотическую стойкость эритроцитов // Лаб. Дело. – 1990. – № 7. – 31 с.
2. Андрийчук А.В., Ткаченко Г.М., Кургалюк Н.Н., Ткачева И.В., Грудневска Й., Вартовник М.С. Пероксидная резистентность эритроцитов и содержание маркеров окислительного стресса в крови лошадей украинской верховой породы в динамике физических нагрузок // Известия КГТУ. – 2015. – № 36. – 46 с.
3. Woollard K.J., Sturgeon S., Chin-Dusting J.P., Salem H., Jackson H. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury // The Journal of Biological Chemistry. – 2009. – 284 p.
4. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и окислительные модификации макромолекул: польза, вред и защита // Соросовский образовательный журнал. – 1999. – № 1. – 63 с.
5. Половинкина Е.О., Синицына Ю.В. Окислительный стресс и особенности воздействия слабых стрессоров физической природы на перекисный гомеостаз растительной клетки: учебно-методическое пособие. – Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2010. – 62 с.
6. Бенисович В.И., Идельсон Л.И. Образование перекисей непредельных жирных кислот в оболочке эритроцитов при болезни Маркиафа-Микели // Вопр. мед. химии. – 1973. – № 6. – С. 596–599.
7. Патент 2134420. Российская Федерация МПК G01N33/50 Способ определения перекисной резистентности эритроцитов / Михайлов С.С.; заявитель и патентообладатель Санкт-Петербургская государственная академия физической культуры им. П.Ф. Лесгафта; Михайлов С.С., Романчук Л.А., Фактор Э.А. заявл.: 09.04.97; опубл.: 10.08.99.

При воздействии различных внешних и внутренних факторов могут изменяться морфологические и функциональные характеристики, которые обеспечивают целостность эритроцитов. Существует ряд факторов, таких как осмотические, механические, химические, температурные, к которым нормальный эритроцит способен противостоять до определенного предела. Такая способность кровяных клеток обусловлена понятием резистентности, которая в свою очередь зависит от возраста форменных элементов и может уменьшаться в ходе их старения [1]. Уменьшение резистентости эритроцитов до минимальных значений приводит к гемолизу. Гемолиз – это процесс разрушения мембран эритроцитов, сопровождающийся выходом гемоглобина в плазму крови. Плазма в таком случае будет окрашиваться в красный цвет, по другому ее называют «лаковая кровь». Гемолиз может проходить как in vivo так и in vitro [2].

Перекись водорода – одна из активных форм кислорода, которая способна вызывать гемолиз эритроцитов. Образование перекиси водорода может наблюдаться при различных процессах, таких как действие гормонов, гипероксия, инфекционные заболевания. Главными мишенями клетки являются липиды и белки мембраны эритроцита, а также внутриклеточный белковый компонент. При недостатке витамина Е и внесении перекиси водорода наблюдается перекисное окисление фосфолипидов мембраны и последующий гемолиз по коллоидно-осмотическому типу. Фракцией липидов наиболее чувствительной к окислению является фосфатидилэтаноламин [3].

Против агрессивного действия свободных радикалов перекиси водорода действует специальная антиоксидантная система. Она состоит из ферментов, которые обеспечивают защиту эритроцитарной мембраны при окислении. К таким ферментам относятся: супероксид-дисмутаза (СОД), каталаза, глутатионзависимые пероксидазы и трансферазы, удаляющие органические перекиси.

Продукты перекисного окисления могут быть как «индикаторами», так и «первичными медиаторами» стресса как особого состояния клетки, которое может привести к увеличению ее резистентности [4].

Выработка активных форм кислорода (Н2О2) увеличивается при высвобождении из гена ионов трехвалентного железа. Такие активные формы способны приводить к прилипанию клеток крови к стенкам сосудов и вызывать окисление липопротеинов низкой плотности. В результате образуются перекиси липидов и нарушается структура и проницаемость мембраны эритроцитов. Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) играют важную роль в нормальном функционировании клетки и выступают ключевыми звеньями реакции организма на стресс [5].

Из литературных источников известно, что резистентность эритроцитов к воздействию различных факторов имеет информативный характер для оценки функционального состояния организма и его общей устойчивости к интенсивным физическим нагрузкам [2].

Содержание железа в окисленной форме соотносится с риском сердечнососудистых заболеваний, что объясняет постоянный научный интерес к изучению факторов, отвечающих за устойчивость эритроцитов к гемолизу. Особую актуальность приобретает изучение пероксидной резистентности клеток крови, так как повышенное содержание перекиси водорода в кровяном русле отмечается при различных патологических состояниях, в том числе инфекциях и воспалении [4].

Для изучения физико-химических свойств мембран клеток крови применяют метод определения перекисной резистентности эритроцитов.

Таким образом, целью нашего исследования является проведение литературного обзора изучения перекисной резистентности эритроцитов крови человека с использованием различных методик.

Исследование перекисной резистентности эритроцитов крови человека проводилось по двум методикам. Оба метода производят оценку перекисной резистентности эритроцитов на основе расчетов таких показателей как: оптическая плотность пробы, подвергшейся перекисному гемолизу; оптическая плотность, соответствующая 100 % гемолизу и оптическая плотность, характеризующая спонтанный (без Н2О2) гемолиз эритроцитов. Первая методика описанная В.И. Бенисовичем заключается в ингибиции эритроцитарной каталазы при помощи азида натрия для оценки резистентности мембран эритроцитов к перекисному окислению, инициированному H2O2. Данная методика предполагает приготовление суспензии эритроцитов, растворов перекиси водорода и азида натрия на забуференном физиологическом растворе с уровнем рН равным 7,4. Затем следует приготовление двух опытных проб путем добавления 2 мл 0,068 % раствора перекиси водорода к 2 мл 5 % суспензии эритроцитов и 0,16 мл 0,2 % раствора азида натрия. Третья проба является контрольной и предназначается для определения спонтанного гемолиза эритроцитов. Данную пробу получают смешиванием тех же объемов суспензии эритроцитов и раствора азида натрия, которые использовали при приготовлении двух опытных проб, но вместо раствора перекиси водорода берут равный объем забуференного физиологического раствора с pH 7,4. Инкубация проб производится в термостате в течение одного часа при 37oC. Для получения 100 % гемолиза эритроцитов к одной из опытных проб добавляют 0,2 мл 4 % раствора сапонина. Центрифугирование всех проб происходит после инкубации 10 минут при 2000 об/мин. После центрифугирования происходит осаждение эритроцитов, а надосадочную жидкость используют для определения степени гемолиза. Для этого к 0,3 мл надосадочной жидкости добавляют 2,7 мл трансформирующего раствора, который дает окрашенный комплекс с Fe3+гемоглобина. После этого на спектрофотоколориметре определяют оптическую плотность E541, пропорциональную количеству гемоглобина в пробе [6] .

В исследовании перекисной резистентности эритроцитов по второй методике предложенной С.С. Михайловым преследуется цель оценить общую резистентность эритроцитарных мембран, включая действие эритроцитарной каталазы, разлагающей перекись водорода. Величину перекисной резистентности определяют с учетом разбавления суспензии эритроцитов. Эритроциты дважды промывают физиологическим раствором и готовят 4,4 % суспензию. В эксперименте используется перекись водорода с исходной рабочей концентрацией 2,2 %. Такая концентрация обеспечивает удобную для измерения величину оптической плотности гемолизата (от 0,1 до 0,8). В данном методе также используются опытные и контрольная пробы. Для наиболее точного получения результата используют 10 образцов из одной и той же донорской крови. Оптическую плотность определяют на спектрофотометре при длине волны 536 нм. В кювету объемом 1 мл вносят 0,8 мл забуференного физиологического раствора (pH 7,4), добавляют 0,1 мл суспензии эритроцитов. Содержимое перемешивают [7].

По данной методике также проводится оценка перекисной устойчивости эритроцитов. Для получения результатов используются три параметра каждой пробы («а», «б» и «в»), которые представлены ниже в формуле (1), определяются непосредственно в одной и той же спектрофотометрической кювете.

Сначала вычисляется величина «в», характеризующая спонтанный гемолиз. По данным предварительных опытов было выяснено, что в условиях описываемого определения в течение 60’ спонтанный гемолиз практически пропорционален времени инкубации. Сразу же после вышеописанного перемешивания пробу в спектрофотометрической кювете центрифугируют (5’, 3000 об/мин) и определяют оптическую плотность надосадочной жидкости при длине волны равной 536 нм. Затем получают E0, т.е. нулевую точку на графике. Далее осадок взмучивают и после 30’ инкубации при 37oC снова центрифугируют и определяют оптическую плотность E30. Затем по графику с учетом линейной зависимости путем экстраполяции получают E60. В данном случае E60 = 2 E30 – E0. Для получения значения «а» определяют оптическую плотность опытной пробы после добавления 1 мл 2,2 % раствора перекиси водорода и при постоянном покачивании кюветы. После чего содержимого пробы инкубируют в течение 30’ при той же температуре. Затем пробу центрифугируют (5’, 3000 об./мин) и определяют оптическую плотность.

Далее в кюветы вносят стеклянную палочку, смоченную в растворе сапонина, обеспечивающего 100 % гемолиз, затем пробу снова центрифугируют и определяют величину «б» путем фотометрирования.

Обработку данных проводят по формуле

А = 100 (а – в)/(б – в),

где а – величина оптической плотности опытной пробы E541 или Е536; б – величина оптической плотности при полном (100 %) гемолизе под влиянием сапонина; в – величина оптической плотности контрольной пробы – характеристика спонтанного гемолиза эритроцитов в условиях опыта.

Данная формула определяет степень гемолиза А (в %) под влиянием перекиси водорода. Рассчитанная таким образом средняя перекисная резистентность эритроцитов для группы здоровых людей А = 8,9 + 1,13 [7].

По итогу проведения литературного обзора были выявлены недостатки первой методики определения перекисной устойчивости эритроцитов. Во-первых, при приготовлении проб количество эритроцитов оказывается различным во всех пробах, особенно при проведении массовых поточных определений. Соответственно оценка степени гемолиза эритроцитов в опытной пробе по отношению к пробе со 100 % гемолизом сопровождается существенной ошибкой. Таким образом неоднородность суспензии эритроцитов и необходимость приготовления отдельной пробы для проведения 100 % гемолиза негативно сказываются на точности метода. Во-вторых, по ходу определения устойчивости эритроцитов к перекиси водорода неоднократно приходится манипулировать малыми объемами субстрата и используемых реактивов. При измерении этих объемов создается погрешность, что также негативно сказывается на точности конечного результата. Второй представленный нами метод учитывает недостатки первого, тем самым является наиболее выгодным для применения в оценке перекисной резистентности эритроцитов. В данном способе не применяются азид натрия и трансформирующий раствор. Так как о степени гемолиза можно судить по оптической плотности E536, которая непосредственно отражает концентрацию гемоглобина. Недостатки предыдущего метода были устранены с помощью индивидуализации каждой пробы. Суспензия эритроцитов, помещенная в спектрофотометрическую кювету, уже не покидает ее и используется сначала для определения спонтанного гемолиза, потом для определения гемолиза, вызванного добавлением H2O2, и, наконец, для определения полного гемолиза, обусловленного добавлением сапонина.

Учет и исправление недостатков первого метода обуславливает повышение точности полученных результатов во втором методе. Таким образом методика предложенная С.С. Михайловым является значительно упрощенной в плане использования минимального набора реактивов и экономически выгодной из-за ненадобности использования трансформирующего раствора.


Библиографическая ссылка

Вельш О.А., Филончикова Е.С., Трофимова Е.Е. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДИК ОЦЕНКИ ПЕРЕКИСНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ НА ОСНОВЕ ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ // Научное обозрение. Педагогические науки. – 2019. – № 5-2. – С. 52-54;
URL: https://science-pedagogy.ru/ru/article/view?id=2166 (дата обращения: 26.10.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074