science-review.ru
В мире рак печени является пятой локализацией по числу ежегодно регистрируемых новых случаев (437 тыс. или 5,4 % от всех злокачественных заболеваний) и четвертой по количеству смертей (427 тыс. или 8,2 %) [1–3]. Ежегодно в мире выявляют около 800 тыс. больных. В России гепатоцеллюлярный рак составляет 1,7–2,5 % всех злокачественных новообразований [1, 4]. Метастатическое поражение печени выявляется у 20–70 % онкологических больных [1]. Резекция печени в большинстве случаев остается основным методом лечения, но радикальную операцию удается выполнить только у 60–70 % [2, 4]. Опуская крайние варианты, частота развития пострезекционной печеночной недостаточности варьирует в пределах от 0,7 до 9,1 % [3,5,6]. Пятилетняя выживаемость больных с данным осложнением в лучших клиниках мира не превышает 38–50 % [3, 4, 6].
Таким образом, на современном этапе развития медицины, поиск новых методов стимуляции репаративной регенерации печени остается актуальной задачей, решение которой приведет к уменьшению сроков восстановления печеночной ткани, снижению риска развития печеночной недостаточности.
Цель исследования. Повышение эффективности профилактики пострезекционной печеночной недостаточности, путем потенцирования метилирования ДНК гепатоцитов цианокобаламином.
Материалы и методы исследования
Эксперименты проводили на 54 лабораторных животных – половозрелых самцах крыс линии Wistar, которых разделили на 3 группы по 18 в каждой. Всем животным осуществляли типичную резекцию в объёме 70 % от исходной массы печени. В 1-й группе лечение не проводилось и она рассматривалась как контрольная. Во 2-й группе непосредственно после резекции в сохраненные доли печени вводили 0,9 % раствор хлорида натрия. В 3-й группе животных интраоперационно в паренхиму сохранённых долей печени вводили витамин B12 в концентрации 200 мкг/мл. Животных выводили из эксперимента на 1–е, 7–е и 14–е сутки после операции, взвешивали массу регенерировавшей печени, производили забор крови для оценки биохимических показателей (билирубин, щелочная фосфатаза, аминотрансферазы, гамма-глутамил-транспептидаза, холестерин, белки, глюкоза, мочевина, креатинин), и факторов роста (IL- β и TGF- β1). Осуществляли оценку показателей окислительного стресса (МДА, SH-группы, СОД, ДНФГ). Также производили взятие гистологического материала (паренхимы печени). Изучали морфологические особенности резецированной печени, проводили оценку пролиферативной активности гепатоцитов – иммуногистохимическое исследование (окрашивание Ki-67). Статистическая обработка выполнялась с помощью пакета «Описательная статистика» программы Excel, для оценки достоверности различий рассчитывали критерий сравнения Стьюдента. Достоверными считались различия при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
При оценке регенерировавшей массы печени на момент выведения животных из эксперимента в контрольной группе животных на 1 сутки отмечается восстановление 36,38 %±3,06 % от исходной массы печени, во 2-й группе – 41,91 %±5,02 %, в 3-й группе – 46,33 %±2,35 %; к 14 сутки в 3-й группе животных наблюдается практически полное восстановление массы печени – 94,26 %±2,96 %, в сравнении с контрольной группой (80,98 %±4,63 %) (рис. 1).
При проведении биохимического анализа крови к 14 суткам исследования отмечается нормализация уровней следующих показателей: билирубин, АСАТ, АЛАТ, креатинин, мочевина, холестерин в 3-й группе животных, в сравнении с контрольной группой, в которой нормализации показателей не наблюдается. При оценке уровня в крови животных цитокина IL- β в 3 группе животных отмечается нарастание содержания с 1 по 14 сутки (26,44±2,6 пг/мл – 1–е сутки, 89,33±9,78 пг/мл – 14–е сутки), в 1-й и 2-й группах животных наибольший показатель наблюдается на 7 сутки 35,24±7,39 пг/мл и 62,22±8,12 пг/мл соответственно (рис. 2,3). При внутрипеченочном введении цианокобаламина на 1-е сутки исследования экспрессия TGF-β1 повышается в 2 раза в сравнении с контрольной группой.
Рис. 1. Динамика восстановления массы печени после типичной резекции
При оценке показателей окислительного стресса в 3 группе животных в сравнении с контрольной группой к 14 суткам исследования отмечается снижение уровней МДА на 17,12 %±3,5 % и ДНФГ на 12,33 %±4,08 %, повышение уровней СОД и SH-групп на 30,17 %±4,03 % и 21,56 %±3,75 % соответственно. Полученные результаты биохимического исследования крови свидетельствуют о восстановлении обменных процессов в печени к 14 суткам исследования. Усиление экспрессии TGF- β1 и IL- β при введении цианокобаламина способствует ускорению процессов репаративной регенерации, т.к. данные факторы являются первичными митогенами, активирующими митотическое деление. Снижение уровней МДА и ДНФ, повышение уровней СОД и SH-групп свидетельствует о снижении окислительного стресса.
При световой микроскопии биоптатов печени окрашенных гематоксилином-эозином на 1 сутки исследования, выявлено наличие одноядерных и двуядерных гепатоцитов в соотношении 9:1. Значительное увеличение количества двуядерных гепатоцитов к 14 суткам отмечается в 3-й группе животных (21,3 %±3,68 %), в сравнении с контрольной группой (12,71 %±5,51 %). Это связано с тем, что при внутрипеченочном введении витамина В12 в митотический цикл вступают не только способные к активному делению гепатоциты, но и стареющие, что приводит к незавершенному митозу и образованию двуядерных клеток. Так как общим принципом репаративной регенерации является прежде всего восстановление суммарного тканевого генома, полиплоидизацию, получаемую в данном случае, можно назвать эквивалентом клеточного размножения.
Рис. 2. Оценка уровня в крови животных цитокина IL-β (* – p<0,05 при сравнении 2-й контрольной группы с 1-й контрольной группой; ** – p<0,05 при сравнении 1-й опытной группы с 1-й контрольной группой)
Рис. 3. Оценка уровня в крови животных экспрессии TGF-β1 (* – p<0,05 при сравнении 2-й контрольной группы с 1-й контрольной группой; ** – p<0,05 при сравнении 1-й опытной группы с 1-й контрольной группой)
При иммуногистохимическом исследовании ткани регенерировавшей печени отмечается повышение пролиферативной активности одноядерных и двуядерных гепатоцитов после типичной резекции во всех экспериментальных группах. На 14 сутки исследования наибольшая пролиферативная активность наблюдается при введении цианокобаламина (индекс пролиферации одноядерных гепатоцитов – 6,22 %±0,54 %, двуядерных гепатоцитов – 0,059 %±0,034 %) в сравнении с контрольной группой (индекс пролиферации одноядерных гепатоцитов – 2,54±0,29 %, двуядерных гепатоцитов – 0,039±0,027 %). Полученный результат подтверждает повышение пролиферативной активности гепатоцитов при внутрипеченочном введении цианокобаламина.
Заключение
Предложенный метод улучшения эффективности профилактики пострезекционной печеночной недостаточности обеспечивает наиболее быстрое восстановление анатомической и функциональной целостности печени. Потенцирование метилирования ДНК к 14 суткам исследования приводит к восстановлению 94,26 %±2,96 % от исходной массы печени, нормализации уровня биохимических показателей крови, повышению выработки фактора роста TGF-beta1, усилению активности цитокинов, снижению окислительного стресса, повышению пролиферативной активности гепатоцитов.