science-review.ru
Одна из приоритетных функций этого органа – детоксикационная, состоит в обезвреживании эндогенных и экзогенных токсических веществ. Сложность структуры, полифункциональность, быстрота вовлечения печени в деструктивные и репаративные процессы – все это определяет неослабевающий интерес исследователей к проблемам ее регенерации, а в частности, к источникам и механизмам. В связи с этим цель нашего исследования – изучение динамики интегральных показателей состояния организма, гистотопографии печеночного ацинуса и ультраструктуры гепатоцитов в условиях многократного действия этаноловой интоксикации.
Избыточное поступление экзогенного этанола в организм сопровождается патологическими изменениями в обмене углеводов, липидов, белков, нейромедиаторов, гормонов, активацией свободно-радикальных процессов в тканях [1].
Печень образована на 80 % паренхимными клетками – гепатоцитами и на 6,5 % непаренхимными (мезенхимными, стромальными) – клетки Ито, клетками Купфера, эндотелиальными, Рit-клетками, внутрипеченочными лимфоцитами [2]. Гепатоциты – высокодифференцированные клетки, основная масса которых находится в G0–фазе клеточного цикла.
Основной структурной единицей принято считать печеночную дольку. Но в последние десятилетия понятие о печеночной дольке перетерпело значительные изменения. В настоящее время рассматриваются три модели печеночных долек: классическая, портальная и ацинарная [3]. Классические дольки отделены друг от друга соединительной тканью [4].
Следующая структурно-метаболическая единица – ацинус – имеет форму ромба, вершины которого образованы центральными венами соседних гексогональных печеночных долек и смежными портальными зонами; не является частью классической дольки, располагается на территории двух соседних классических долек [5].
Забор образцов печени мышей для гистологических исследований проводился после многократной этаноловой интоксикации: через 20 минут (острый эксперимент), через 1-е, 3-и, 7-е и 15-е сутки. Раствор этанола (DL50) подавался животным в качестве единственного источника питья три раза через трое суток.
Забор материала проводился под легким эфирным наркозом. Печень забиралась из правой крупной доли печени с последующей фиксацией в 10 % забуференном нейтральном формалине и заливкой в парафин далее изготавливали серийные срезы по стандартной методике.
Для морфологического анализа образцы печени фиксировали в 10 % – нейтральном забуференном формалине, заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином. На гистологических срезах печени определяли диаметр сосудов ацинуса портального тракта: артериолы, венулы, желчного протока, лимфатического русла, а также синусоидных капилляров и центральной вены.
Анализ показателей периферической крови проводился с помощью геманализатора MEK-6450K, (NihonKondeh Япония).
Электронномикроскопическое исследование проводилось для оценки объемной плотности (мкм3/мкм3) Vv, поверхностной плотности (мкм2/мкм3) – Sv и численной плотности (мкм0/мкм3) Nv митохондрий, хроматина, ядрышка, липидов, лизосом, гликогена гепатоцитов. Для этого в каждом случае анализировали 50 полей зрения паренхимы печени, произвольно отснятых при просмотре материала в электронном микроскопе при увеличении 3000–20000. Объемную, поверхностную и численную плотность изучаемых структур измеряли на электроннограммах с использованием встроенной программы «UTHSCSA ImageTool 3.0» Количественные параметры оценивалась на единицу площади (100 мкм2) паренхимы печени. Образцы печени животных фиксировали погружением в 4 % растворе параформа на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением сахарозы (5 %). После фиксации заключали в парафин, готовили фронтальные срезы толщиной 10мкм, окрашивали 0,1 % толуидиновым синим, дофиксировали в 1 % растворе четырехокиси осмия и заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца. Просмотр и фотографирование ультратонких срезов производили на электронном микроскопе «Hitachi-600H» (Япония).
После многократного получения этанола в виде единственного источника питья остром периоде и на протяжении 15–ти суток наблюдений отмечается нарушение кровоснабжения печеночного ацинуса. Об этом свидетельствуют количественные показатели, так в остром опыте отмечается увеличение внутреннего диаметра венулы и синусоидных капилляров II и III зоне ацинуса на 10 %, 16 %, 14 % соответственно в сравнении с контрольной группой.
На первые сутки эксперимента внутренний диаметр венулы увеличивается на 8 %, диаметр синусоидных капилляров во II и III портальных зонах на 27 % и 12 %.
На 3-е сутки просвет венулы увеличивается на 9 %. Диаметры синусоидные капилляров в центролобулярной и перивенулярной зонах увеличиваются на 27 % и 12,4 %.
На 7-е сутки анализ динамики изменения показателей внутреннего диаметра сосудов портального тракта выявил незначительное увеличение диаметра венулы на 1 %. Диаметры синусоидных капилляров в центролобулярной зоне практически сравнялись и перивенулярной зонах остаются увеличенными на 20 %.
На 15-е сутки в перивенулярной зоне утрачивается балочное расположение гепатоцитов, увеличивается межклеточный просвет, сохраняется ориентация разрастания волокон коллагена из области портального тракта к центральной вене, но и в перивенулярной области этот процесс не затухает, и тяжи волокон внедряются в паренхиму. Диаметры синусоидныых капилляров в центролобулярной зоне незначительно ниже контроля на 5 % и перивенулярной зоне остаются увеличенными на 24 %. Диаметр венулы увеличен на 1 %.
Показатели периферической крови отражают угнетение клеточного и гуморального иммунитета, который постепенно восстанавливается от острого опыта к 3-е суткам. Так в остром опыте показатель общего числа лейкоциты увеличивается более чем в три раза, средний объем эритроцитов, наоборот, снижается на 1 %, средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах снижается на 5 %, показатель количество тромбоцитов увеличивается на 25 % и показатель гетерогенности тромбоцитов снижается на 6,8 %.
На первые сутки эксперимента наблюдается небольшое уменьшение у показателей MCV на 9,2 %, MCHC на 1,2 % и RDW на 7,7 %. В свою очередь на третьи сутки небольшое уменьшение наблюдается MCV на 9,2 %, MCHC на 1,2 % и RDW на 7,7 %.
На седьмые сутки эксперимента сутки после алкоголизации выявлены следующие изменения показателей крови: наблюдается уменьшение показателя WBC на 25 %. В свою очередь небольшое увеличение наблюдается у показателей MCV на 2,9 %, MCHC на 2 % и уменьшение RDW на 1,8 %, PLT на 3 %.
На пятнадцатые сутки после алкоголизации выявлены следующие изменения показателей крови: наблюдается значительное уменьшение показателя WBC – 52 %. В свою очередь увеличение наблюдается у показателей MCV на 24 %, MCHC на 25 % и RDW на 25 %, PLT на 45 %.
На субклеточном уровне выявлено, что в остром эксперименте наблюдается снижение Vv митохондрий на 50 %, Vv ядра на 15 %, Vv ядрышка на 35 % и Vv липидов на 13 %. На первые сутки Vv митохондрий уменьшается 12 %, ядра на 5 %, ядрышка на 32 % и Vv липидов увеличивается на 42 %.
На третьи сутки эксперимента снижается Vv митохондрий на 30 %, Vv ядра на 15 % и Vv ядрышка на 30 %, что отражает нарушение работы генов и нарушение клеточного дыхания. Объемная плотность липидов Vv наоборот увеличивается на 17 %.
На 7 сутки Электронномикроскопически выявлено, что объемная плотность митохондрий остается меньше по сравнению с контролем на 16 %, что может отражать нарушение клеточного дыхания. Ближе к контролю становятся показатели объема ядра на 8 % и на 30 % уменьшился показатель объема ядрышка, уменьшение объема ядрышка говорит о замедлении процесса сбора рибосом и как следствие в цитоплазме снижается интенсивность синтеза белка. Тогда как объем липидов – 43 % увеличивается, на фоне снижения интенсивности снижения белка активируется процесс липогенезе, за счет активации алкогольдегидрогеназы и проявляются все начальные признаки ожирения печени. На пятнадцатые сутки уменьшается объемная плотность митохондрий на 30 %, объемная плотность ядра и ядрышка на 45 % и 27 % соответственно. Объем липидов на 40 % увеличился.
Таким образом наши исследования выявили изменения со стороны сосудистого русла печеночного ацинуса, большем притоке венозной крови с реактивными метаболитами (особенно на 3-и сутки эксперимента), увеличение просвета синусоидных капилляров в центролобулярной и перивенулярной зоне ацинуса могут вызывать аутоповреждения гепатоцитов, что проявляется в полученных ультраструктурных показателях. Так достоверно выявлено снижение объемной плотности митохондрий (особенно в остром опыте), ядра и ядрышка (также в большей мере в остром опыте), это указывает на нарушение отвода электронов от митохондрий для использования во внутриклеточном метаболизме и развитие метаболичесской депрессии. Изменения объемных показателей ядра и ядрышка отражают затухание матричных синтезов, так как с ядрышками связаны процессы транскрипции и процессинга р-РНК. Размеры и структура ядрышек в большинстве случаев коррелируют с объемом клеточного белкового синтеза гепатоцитами. Изменения объемных показателей ядра отражает нарушение процессов перестройки гетерохроматина, которая осуществляется в соответствии с потребностями синтеза РНК и белка, обеспечивая согласование уровней транскрипции и трансляции. Объемные показатели липидов снижаются в остром опыте и на 1-е сутки, на 3-и сутки наоборот увеличиваются, это указывает на токсическое действия этанола результатом которого является нарушение обмена липидов, что сопровождается снижение утилизации жирных кислот гепатоцитами с одной стороны с другой стороны увеличение объемных показателей липидов может указывать на использование продуктов их расщепления в качестве источника эндогенной воды. Выявленные интегральные показатели проявляются в стойком снижение показателей объемных показателей эритроцитов и содержания в них гемоглобина, а также в гетерогенности тромбоцитов. В остром опыте резко увеличивается число лейкоцитов (лейкоцитоз) и тромбоцитов. Это отражает нарушение транспорта газов крови, в свою очередь резкое увеличение количества тромбоцитов на протяжении всего эксперимента отражает увеличение свертываемости крови. Увеличение общего количества лейкоцитов указывает на стресс в ответ на действие этаноловой интоксикации.