science-review.ru
Регенерация печени – это комплекс жестко регулируемых процессов пролиферации гепатоцитов, непаренхимных клеток и последующего восстановления нарушенной функции органа после его повреждения [1]. Одним из гепатотоксикантом является этанол, который не является чужеродным агентом для печени. Особую важность представляют комплексные исследования механизмов регенерации печени в условиях этаноловой интоксикации с учетом что исследования также носят важную биосоциальную значимость [2]. Цитокины, такие как интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-6 (ИЛ-6), туморнекротизирующий фактор (TNF-α), а также простагландины, синтезируемые клетками Купфера, способны воздействовать на гепатоциты в острую фазу ответа на повреждение и играют существенную роль в их пролиферации и дифференцировке [3].
Интерес к процессу физиологической гибели клеток неуклонно растет, что связано с выявляемыми его нарушениями в ряде патологических состояний, в том числе при аутоиммунных и онкологических заболеваниях [4, 5]. В связи с этим целью нашего исследования являлось изучить динамику цитокинов с позиции цитокоммуникативных взаимодействий паренхимных и непаренхимных клеток печени, а также показатели клеточного цикла гепатоцитов и распределение клеток по этапам апоптоза в норме и после воздействия этанола в однократном режиме.
Эксперимент поставлен на беспородных нелинейных мышах Mus Musculus, животные получали этанол в виде единственного источника питья. Забор материала проводили в остром опыте, через 1, 3-е, 7-е и 15-е сутки. Цитокоммуникативные индукции в печени определяли по уровню содержания цитокинов TNF-α, IL-1β и IL-6. Для этого готовили гомогенат печени на гомогенизаторе WiseStir HS-30D (Daihan Scientific, Южная Корея), далее гомогенат центрифугировали (Beckman Coulter, Германия) в течение 5 минут при Т 48°С, при 700 об/мин., собирали супернатант, в котором и определяли уровень цитокинов методом проточной цитометрии согласно инструкции изготовителя.
Для анализа клеточного цикла гепатоцитов готовили гомогенат на гомогенизаторе WiseStir HS-30D (Daihan Scientific, Южная Корея) на фосфатно-солевом буфере (PBS, pH=7,4, Gibco, США), который центрифугировали на центрифуге (Beckman Coulter, Германия) в течение 5 минут при 1500 об/мин, далее супернатант отбрасывали и осадок ресуспендировали в PBS. Процедуру повторяли три раза. К осадку добавляли 5 мл 2 % раствора параформальдегида в PBS, ресуспензировали. Полученную суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр СellTrics (Partec, Германия) с диаметром пор 100 мкм. К полученному осадку гепатоцитов добавляли 1 мл раствора пропидиум йодида для окрашивания. Осадок гепатоцитов ресуспендировали и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. Окрашенную суспензию, объёмом 1 мл, фильтровали через нейлоновый фильтр СellTrics (Partec, Германия) с диаметром пор 30 мкм. и полученный образец, объёмом в 1 мл. анализировали на цитофлюориметре (Partec, Германия). Для оценки стадии апоптоза в ткани печени применялась детекция апоптоза методом TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling). В результате проведенных исследований было выявлено, что у особей в остром эксперименте гепатоцитов в активных фазах цикла пролиферации (S+G2+M) и полиплоидизации гепатоцитов больше чем в контрольной группе почти в пять раз. На первые сутки этот показатель увеличивается в два раза. На третьи сутки в эскпериментальной группе увеличение числа гепатоцитов в активных фазах цикла пролиферации (S+G2+M) и полиплоидизации гепатоцитов происходит почти в три раза.
Количество диплоидных гепатоцитов (G0/G1) в остром эксперименте по сравнению с контрольной группой остается на прежнем уровне, на первые и третьи сутки в этаноловой группе снижается более чем в два раза в сравнении с контролем.
На седьмые сутки эксперимента, сохраняется тенденция к снижению числа гепатоцитов в G0/G1 стадии клеточного цикла (в два раза) и увеличение числа гепатоцитов в три раза в стадии активных фазах цикла пролиферации (S+G2+M) и полиплоидизации.
На пятнадцатые сутки показатели остаются на прежнем уровне, что и на седьмые сутки. Соотношение живых и погибших гепатоцитов по сравнению с контролем увеличивается почти в 15 раз.
По проведенному анализу выявлено: в контрольной группе процент клеток, которые не секретирующих ни один из анализируемых интерлейкинов составляет 91,6 %. 5 % клеток секретирует интерлейкин TNF-α, тогда как интерлейкин IL-1β около 3 %. Интерлейкин IL-6 секретируется 20 % клетками.
В остром опыте в экспериментальной группе процент клеток, не синтезирующих ни один интерлейкин составляет 73 %, IL-1β синтезирует 25 % клеток, TNF-α синтезирует около 0,78 %, тогда как IL 6 почти 11 % клеток.
Количество клеток на первые сутки после однократной этаноловой интоксикации, которые не секретируют ни один из интерлейкинов составляет 92 %, секретирующих только интерлейкин TNF-α 0,4 %, интерлейкин IL-1β секретируется 7,6 % клеток. Интерлейкин IL 6 секретируется 11 % гепатоцитов.
Изменения динамики секреции интерлейкинов на третьи сутки после однократной этаноловой интоксикации выявил, что количество клеток, которые не продуцируют ни один из исследуемых цитокоммуникаций составляет 93 %. Количество клеток, секретирующих интерлейкин TNF-α на 2 %, IL-1β синтезируют 4 % гепатоцитов, а интерлейкин IL-6 секретируют 16 %.
Динамика показателей цитокоммуникаий гепатоцитов на седьмые сутки распределяется следующим образом. Незначительно снижается показатель количества клеток, не продуцирующих ни один интерлейкин, тогда как количество гепатоцитов, синтезирующих TNFα снижается почти в два раза. Но в то же время наблюдается увеличение синтеза TGF-1β, а именно количество клеток, синтезирующих данных интерлейкин увеличивается в 2 раза. Снижается количество гепатоцитов, синтезирующих TGF 6 на 20 %.
В алкоголизированной группе на пятнадцатые сутки на 2 % увеличивается процент клеток, не синтезирующих ни один из изучаемых интерлейкинов. Отмечается резкое снижение количества гепатоцитов, секретирующих TNFα в пять раз. Почти в два раза увеличивается количество клеток, которые синтезируют TGF-1β, и снижается количество клеток печени, продуцирующих TGF 6 на 29 %.
Таким образом количество клеток, которые не продуцируют ни один из исследуемых цитокинов снижается и в большей мере в остром опыте, тогда как к 1-м и 3-м суткам их количество проявляет тенденцию к увеличению выше контрольных показателей числа клеток, которые синтезируют анализируемые цитокины, за исключением TNF-α.
Аннексин V применяли для выявления гепатоцитов, вступивших в апоптоз (аннексин V+ клетки). Пропидий йодид (PI) употребляли в качестве маркера жизнеспособности гепатоцитов (аннексин V-PI- клетки) и клеточного некроза (аннексин V- PI+ клетки). Апоптоз анализировался методом проточной цитофотометрии с учетом этапов таких как сигналинг – он характеризуется переносом серина на Е-поверхность плазматической мембраной, в этом случае применялся краситель PI. Краситель аннексин V отражает процесс разрушения мембраны ядра, что сопряжено с образованием его фрагментов и представляет собой стадию патологии ядра – кариорексис.
После проведенного анализа выявлено, что в остром эксперименте отмечается незначительное снижается процент живых гепатоцитов, при этом увеличивается количество гепатоцитов, погибших по пути апоптоза (PI+ гепатоциты), что составляет почти 10 %. Снижается количество гепатоцитов на этапе сигналинга на 11 % (аннексин V-позитивные – V+). Так же увеличивается количество гепатоцитов, погибших по пути некроза на 2 % (аннексин V-PI+ гепатоциты).
Отмечено что на первые сутки эксперимента снижается количество аннексин V позитивных гепатоцитов на 13 %. В 7 раз увеличивается количество гепатоцитов, находящихся в стадии позднего апоптоза. Также увеличивается количество гепатоцитов, погибших по пути некроза, на 15 %. В экспериментальной группе снижается количество живых гепатоцитов на 8 %.
На третьи сутки происходит увеличение количества гепатоцитов, находящихся в карирексисе в три раза. Также наблюдается тенденция к увеличению других показателей. А именно в эксперименте увеличивается количество гепатоцитов, погибших по пути апоптоза в пять раз. В два раза увеличивается количество гепатоцитов, погибших по пути некроза. В этом случае уменьшается количество живых гепатоцитов в два раза, по сравнению с контрольной группой.
После проведенного анализа, на седьмые сутки были определены следующие показатели. Наблюдается выравнивание показателей, количество живых клеток снижается на 5 %, при этом на 14 % увеличивается количество клеток, которые находятся в ранней стадии апоптоза (аннексин V-позитивные – V+), почти в два раза увеличивается количество гепатоцитов, погибших по апоптотическому пути (PI+ гепатоциты). Незначительно по сравнению с контролем наблюдается снижение гепатоцитов, погибших по пути некроза, а именно на 2 % (аннексин V–PI+ гепатоциты).
Пятнадцатые сутки эксперимента в однократном режиме характеризуются резким снижением количества клеток, находящихся в ранней стадии апоптоза – в два раза (аннексин V позитивные – V+). Наблюдается небольшое увеличение количества гепатоцитов, которые находятся в стадии кариорексиса (PI+ гепатоциты), примерно на 6 %. В 14 раз увеличилось количество клеток, погибших по пути некроза (аннексин V-PI+ гепатоциты). При этом наблюдается увеличение количество живых гепатоцитов на 4 %.
Туморнекротизирующий фактор (TNF-α) – проявляет резкое снижение в остром опыте и на первые сутки эксперимента с тенденцией на увеличение на 3–и сутки, но не достигая контрольных показателей. Это отражает резкое угнетение синтеза клетками Купфера данного цитокина. Выявленная динамика IL-6 отражает устойчивое снижение участия клеток Купфера в процессах пролиферации и дифференцировке гепатоцитов в ответ на повреждение этанолом в исследуемые периоды.
Динамика показателей IL-1β синтезируемый клетками Ито, проявляет резкое увеличение в остром опыте и далее резкое снижение на 1-е и 3-е сутки эксперимента. Это отражает резкое угнетение реагирования специфического иммунного, а также выступая в качестве одного из главных медиаторов, ответственных за развитие неспецифических форм защиты, отражает угнетение формирования местной воспалительной реакции и острофазного ответа, после этаноловой интоксикации, а также отражает угнетение процессах обновления и ремоделирования внеклеточного матрикса (ВКМ) не только путем синтеза структурных матриксных белков клетками Ито, но и путем синтеза и секреции коллагеназ.
Выявленная дифференцированная динамика исследуемых цитокинов обеспечила стимулирование гепатоцитов к пролиферации и как следствие снижение числа диплоидных гепатоцитов в G0/G1 стадии клеточного цикла.